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承接前文,接下来次要报告第三代测序手艺。

第三代测序手艺

测序手艺在近两三年中又有新的里程碑。以PacBio的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单份子测序手艺,被称之为第三代测序手艺。与前两代比拟,他们最大的特性就是单份子测序,测序历程无需停止PCR扩增。

此中PacBio SMRT手艺实在也使用了边分解边测序的思惟,并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是: DNA聚合酶和模板分离,4色荧光标识表记标帜 4 种碱基(即是dNTP),在碱基配对阶段,差别碱基的参加,会收回差别光,按照光的波长与峰值可判定进入的碱基范例。同时这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的枢纽之一,读长次要跟酶的活性连结有关,它次要受激光对其形成的毁伤所影响。PacBio SMRT手艺的一个枢纽是怎样将反响旌旗灯号与四周游离碱基的壮大荧光布景区分出来。他们操纵的是ZMW(zero模波导孔)道理:好像微波炉壁上可看到的许多麋集小孔。小孔直径有讲究,假如直径大于微波波长,能量就会在衍射效应的感化下穿透面板而保守出来,从而与四周小孔互相滋扰。假如孔径小于波长,能量不会辐射到四周,而是连结直线形态(光衍射的道理),从而可起庇护感化。同理,在一个反响管(SMRTCell:单份子及时反响孔)中有很多如许的圆形纳米小孔, 即 ZMW(zero模波导孔),外径 100多纳米,比检测激光波长小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限定在一个小范畴(体积20X 10-21 L)里,恰好充足笼盖需求检测的部门,使得旌旗灯号仅来自这个小反响地区,孔外过多游离核苷酸单体仍然留在黑黑暗,从而实现将布景降到最低。另外,能够经由过程检测相邻两个碱基之间的测序工夫,来检测一些碱基润饰状况,既假如碱基存在润饰,则经由过程聚合酶时的速度会减慢,相邻两峰之间的间隔增大,能够经由过程这个来之间检测甲基化等信息(图7)。SMRT手艺的测序速度很快,每秒约10个dNTP。可是,同时其测序错误率比力高(这险些是今朝单份子测序手艺的通病),到达15%,但幸亏它的堕落是随机的,其实不会像第二代测序手艺那样存在测序毛病的倾向,因此能够经由过程屡次测序来停止有用的纠错。

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图7.PacBio SMRT测序道理

Oxford Nanopore Technologies所开辟的纳米单份子测序手艺与以往的测序手艺皆差别,它是基于电信号而不是光旌旗灯号的测序手艺5。该手艺的枢纽之一是,他们设想了一种特别的纳米孔,孔内共价分离有份子讨论。当DNA碱基经由过程纳米孔时,它们使电荷发作变革,从而长久地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变革幅度是差别的),活络的电子设备检测到这些变革从而审定所经由过程的碱基(图8)。

该在客岁基因组生物学手艺停顿年会(AGBT)上推出第一款商业化的纳米孔测序仪,惹起了科学界的极大存眷。纳米孔测序(和其他第三代测序手艺)无望处理今朝测序平台的不敷,纳米孔测序的主要特点是:读长很长,约莫在几十kb,以至100 kb;错误率今朝介于1%至4%,且是随机毛病,而不是会萃在读取的两头;数据可及时读取;通量很高(30x人类基因组无望在一天内完成);肇端DNA在测序历程中不被毁坏;以及样品制备简朴又自制。理论上,它也能间接测序RNA。

纳米孔单份子测序计较还有另外一大特性,它可以间接读取出甲基化的胞嘧啶,而没必要像传统办法那样对基因组停止bisulfite处置。这关于在基因组程度间接研讨表观遗传相干征象有极大的协助。而且改办法的测序准确性可达99.8%,并且一旦发明测序毛病也能较简单地停止改正。但今朝仿佛还没有使用该手艺的相干报导。

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图8. 纳米孔测序

其他测序手艺

今朝还有一种基于半导体芯片的新一代革命性测序手艺——Ion Torrent6。该手艺利用了一种充满小孔的高密度半导体芯片, 一个小孔就是一个测序反响池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延长中的DNA链上时,会开释出一个氢离子,反响池中的PH发作改动,位于池下的离子感受器感受到H+离子旌旗灯号,H+离子旌旗灯号再直接转化为数字信号,从而读出DNA序列(图9)。这一手艺的发明人同时也是454测序手艺的发明人之一——Jonathan Rothberg,它的文库和样本制备跟454手艺很像,以至可以说就是454的翻版,只是测序历程中不是经由过程检测焦磷酸荧光显色,而是经由过程检测H+旌旗灯号的变革来得到序列碱基信息。Ion Torrent比拟于其他测序手艺来讲,不需要高贵的物理成像等装备,因而,本钱相对来讲会低,体积也会比较小,同时操纵也要更加简朴,速度也相称快速,除了2天文库建造工夫,全部上机测序可在2-3.5小时内完成,不外全部芯片的通量其实不高,今朝是10G阁下,但十分合适小基因组和外显子考证的测序。

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图9. Ion Torrent


2016年07月07日

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全都是测序的干货,一文让你理解一到三代测序(三)

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