承接前文,接下来持续来说第二代测序手艺

第二代测序手艺

总的说来,第一代测序手艺的主要特点是测序读长可达1000bp,准确性高达99.999%,但其测序本钱高,通量低等方面的缺陷,严峻影响了其真正大规模的使用。因此第一代测序手艺其实不是最理想的测序办法。颠末不竭的技术开发和改良,以Roche的454手艺、illumina的Solexa,Hiseq手艺和ABI的Solid手艺为标识表记标帜的第二代测序手艺降生了。第二代测序手艺大大低落了测序本钱的同时,还大幅提高了测序速度,而且连结了高准确性,从前完成一个人类基因组的测序需求3年时间,而利用二代测序手艺则仅仅需求1周,但在序列读长方面比起第一代测序手艺则要短许多。表1和图3对第一代和第二代测序手艺各自的特性以及测序本钱作了一个简朴的比力5,以下我将对这三种次要的第二代测序手艺的次要道理和特性作一个简朴的引见。

图3. 测序本钱的变革

1.     Illumine

Illumina的Solexa和Hiseq应该说是今朝全球利用量最大的第二代测序机械,这两个系列的手艺焦点道理是不异的2,4。这两个系列的机械接纳的都是边分解边测序的办法,它的测序历程次要分为以下4步,如图4.

(1)DNA待测文库构建

操纵超声波把待测的DNA样本打断成小片断,今朝除了组装以外和一些其他的特殊要求以外,次要是打断成200-500bp长的序列片断,并在这些小片断的两头增加上差别的讨论,构建出单链DNA文库。

(2)Flowcell

Flowcell是用于吸附流动DNA片断的槽道,当文库建好后,这些文库中的DNA在经由过程flowcell的时分会随机附着在flowcell外表的channel上。每一个Flowcell有8个channel,每一个channel的外表都附有许多讨论,这些讨论能和建库历程中加在DNA片断两头的讨论互相配对(这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的缘故原由),并能撑持DNA在其外表停止桥式PCR的扩增。

(3)桥式PCR扩增与变性

桥式PCR以Flowcell外表所牢固的讨论为模板,停止桥形扩增,如图4.a所示。颠末不竭的扩增和变性轮回,终极每一个DNA片断都将在各自的位置上集中成束,每个束都含有单个DNA模板的许多分拷贝,停止这一历程的目标在于实现将碱基的旌旗灯号强度放大,以到达测序所需的旌旗灯号要求。

(4)测序

测序办法接纳边分解边测序的办法。向反响系统中同时增加DNA聚合酶、讨论引物和带有碱基特异荧光标识表记标帜的4中dNTP(好像Sanger测序法)。这些dNTP的3’-OH被化学办法所庇护,因此每次只能增加一个dNTP。在dNTP被增加到分解链上后,所有未利用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着,再加入激起荧光所需的缓冲液,用激光激起荧光旌旗灯号,并有光学装备完成荧光旌旗灯号的记载,最初操纵计算机阐发将光学旌旗灯号转化为测序碱基。如许荧光旌旗灯号记载完成后,再加入化学试剂淬灭荧光旌旗灯号并去除dNTP 3’-OH庇护基团,以便能停止下一轮的测序反响。Illumina的这类测序手艺每次只增加一个dNTP的特性可以很好的地处理同聚物长度的精确丈量成绩,它的次要测序毛病滥觞是碱基的交换,今朝它的测序错误率在1%-1.5%之间,测序周期以人类基因组重测序为例,30x测序深度约莫为1周。

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图4. Illumina测序流程

1.     Roche 454

Roche 454测序体系是第一个商业化运营二代测序手艺的平台。它的次要测序道理是(图5 abc)2:

(1)DNA文库制备

454测序体系的文件构建方法和illumina的差别,它是操纵喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片断,并在片断两头加上差别的讨论,或将待测DNA变性后用杂交引物停止PCR扩增,毗连载体,构建单链DNA文库(图5a)。

(2)Emulsion PCR (乳液PCR,实在是一个灌水到油的共同历程)

454固然DNA扩增历程也和illumina的判然不同,它将这些单链DNA分离在水油包被的直径约28um的磁珠上,并在其上面孵育、退火。

乳液PCR最大的特性是能够构成数量宏大的自力反响空间以停止DNA扩增。其关键技术是“灌水到油”(水包油),根本历程是在PCR反响前,将包罗PCR所有反响身分的水溶液注入到高速扭转的矿物油外表,水溶液霎时构成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就组成了自力的PCR反响空间。幻想形态下,每一个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。

这些被小水滴包被的磁珠外表含有与讨论互补的DNA序列,因而这些单链DNA序列可以特异地分离在磁珠上。同时孵育系统中含有PCR反响试剂,以是包管了每一个与磁珠分离的小片断都能自力停止PCR扩增,而且扩增产品仍能够分离到磁珠上。当反响完成后,能够毁坏孵育系统并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增,每一个小片断都将被扩增约100万倍,从而到达下一步测序所要求的DNA量。

(3)焦磷酸测序

测序前需求先用一种聚合酶和单链结合卵白处置带有DNA的磁珠,接着将磁珠放在一种PTP平板上。这类平板上特制有很多直径约为44um的小孔,每一个小孔仅能包容一个磁珠,经由过程这种方法来牢固每一个磁珠的位置,以便检测接下来的测序反响历程。

测序办法接纳焦磷酸测序法,将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中,启动测序反响。测序反响以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板,每次反响参加一种dNTP停止分解反响。假如dNTP能与待测序列配对,则会在分解后开释焦磷酸基团。开释的焦磷酸基团会与反响系统中的ATP硫酸化学酶反响天生ATP。天生的ATP和荧光素酶配合氧化使测序反响中的荧光素份子并发出荧光,同时由PTP板另外一侧的CCD照相机记载,最初经由过程计算机停止光旌旗灯号处置而得到终极的测序成果。因为每一种dNTP在反响中发生的荧光色彩差别,因而能够按照荧光的色彩来判定被测份子的序列。反响完毕后,游离的dNTP会在双磷酸酶的感化下降解ATP,从而招致荧光淬灭,以便使测序反响进入下一个轮回。因为454测序手艺中,每一个测序反响都在PTP板上自力的小孔中停止,因此能大大低落互相间的滋扰和测序偏向。454手艺最大的优势在于其能得到较长的测序读长,当前454手艺的均匀读长可达400bp,而且454手艺和illumina的Solexa和Hiseq手艺差别,它最主要的一个缺陷是无法精确丈量同聚物的长度,如当序列中存在类似于PolyA的状况时,测序反响会一次参加多个T,而所参加的T的个数只能经由过程荧光强度揣测得到,这就有可能招致成果不精确。也恰是因为这一缘故原由,454手艺会在测序历程中引入插入和缺失的测序毛病。

图5. Roche 454测序流程

1.     Solid手艺

Solid测序手艺是ABI于2007年开端投入用于贸易测序使用的仪器。它基于连接酶法,即操纵DNA连接酶在毗连历程当中测序(图6)2,4。它的道理是:

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图6-a. Solid测序手艺

(1)DNA文库构建

片断打断并在片断两头加上测序讨论,毗连载体,构建单链DNA文库。

(2)Emulsion PCR

Solid的PCR历程也和454的办法相似,一样接纳小水滴emulsion PCR,但这些微珠比起454体系来讲则要小很多,只要1um。在扩增的同时对扩增产品的3’端停止润饰,这是为下一步的测序历程作的筹办。3’润饰的微珠会被堆积在一块玻片上。在微珠上样的历程中,堆积小室将每张玻片分红1个、4个或8个测序地区(图6-a)。Solid体系最大的长处就是每张玻片能包容比454更高密度的微珠,在统一体系中轻松实现更高的通量。

(3)连接酶测序

这一步是Solid测序的共同之处。它并没有接纳从前测序时所常用的DNA聚合酶,而是接纳了连接酶。Solid毗连反响的底物是8碱基单链荧光探针混合物,这里将其简朴暗示为:3’-XXnnnzzz-5’。毗连反响中,这些探针根据碱基互补划定规矩与单链DNA模板链配对。探针的5’结尾别离标识表记标帜了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种色彩的荧光染料(图6-a)。这个8碱基单链荧光探针中,第1和第2位碱基(XX)上的碱基是肯定的,并按照品种的不同在6-8位(zzz)上加上了差别的荧光标识表记标帜。这是Solid的共同测序法,两个碱基肯定一个荧光旌旗灯号,相当于一次能决议两个碱基。这类测序办法也称之为两碱基测序法。当荧光探针可以与DNA模板链配对而毗连上时,就会收回代表第1,2位碱基的荧光旌旗灯号,图6-a和图6-b中的比色版所暗示的是第1,2位碱基的差别组合与荧光色彩的干系。在记载下荧光旌旗灯号后,经由过程化学办法在第5和第6位碱基之间停止切割,如许就能移除荧光旌旗灯号,以便停止下一个位置的测序。不外值得留意的是,经由过程这类测序办法,每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位,第二次是第6、7位……在测到开端后,要将新分解的链变性,洗脱。接着用引物n-1停止第二轮测序。引物n-1与引物n的区分是,两者在与讨论配对的位置上相差一个碱基(图6-a. 8)。也即是,经由过程引物n-1在引物n的根底大将测序位置往3’端挪动一个碱基位置,因此就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成,依此类推,直至第五轮测序,终极能够完成所有位置的碱基测序,而且每一个位置的碱基均被检测了两次。该手艺的读长在2×50bp,后续序列拼接一样比力庞大。因为双次检测,这一手艺的原始测序准确性高达99.94%,而15x覆盖率时的准确性更是到达了99.999%,应该说是今朝第二代测序手艺中准确性最高的了。但在荧光解码阶段,鉴于其是双碱基肯定一个荧光旌旗灯号,因此一旦发作毛病就简单发生连锁的解码毛病。

图6-b. Solid测序手艺

 

 

 


2016年07月07日

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